Studi Kasus Menggunakan Alfa-Amilase dengan Teknik Zimografi

Pembahasan

Pada percobaan ini, ditentukan aktivitas dan uji kualitatif terhadap enzim alfa-amilase. Aktivitas enzim alfa-amilase dapat ditentukan dengan teknik zimografi dengan teknik visualisasi menggunakan metode FUWA. Teknik zimografi yang digunakan menggunakan prinsip elektroforesis NATIVE PAGE. Dengan NATIVE PAGE tidak akan terjadi denaturasi enzim alfa-amilase akibat tidak adanya SDS, sehingga tidak akan terjadi penurunan aktivitas dari enzim tersebut, karena perbedaan perlakuan terhadap enzim dilakukan sebelum enzim dimasukkan ke dalam sumur gel. SDS dapat mengubah struktur kuartener protein menjadi unit rantai polipeptida yang bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis senyawa akan bergerak ke kutub postif atau katoda tergantung pada besarnya ukuran molekul. Molekul yang lebih kecil akan bergerak terlebih dahulu, sedangkan molekul dengan ukuran yang besar akan bergerak lambat akibat adanya gesekan dengan gel akrilamid (Tarigan, 2011). 

Metode FUWA merupakan suatu teknik visualisasi yang didasarkan pada pembentukan wana biru akibat adanya kompleks antara pati dengan I3-. Pati dengan dan I3- membentuk warna biru karena I3- terperangkap dalam struktur pati. Apabila terdapat enzim alfa-amilase, maka akan menghidrolisis ikatan alfa-1,4-gikosidik yang terdapat dalam pati, sehingga sturktur pati menjadi terbuka. Oleh karena itu terjadi pengurangan intensitas warna biru karena berkurangnya kompleks antara pati dengan I3-.  

Pada percobaan ini, dilakukan variasi terhadap enzim alfa-amilase yaitu dengan sampel A berisi enzim alfa-amilase saja, sedangkan pada sampel B dan C merupakan enzim yang sudah terdenturasi dan terkoagulasi. Pada sampel B dan C diberikan perlakuan yang berbeda. Sampel B merupakan enzim alfa-amilase yang ditambahkan dengan asam trikloro asetat (TCA). Sedangkan sampel C mengandung enzim yang telah diinkubasi pada suhu 70 derajat celcius. Penambahan TCA menyebabkan enzim alfa-amilase mengalami denaturasi karena adanya kerusakan struktur. Inkubasi pada suhu 70 derajat celcius juga menyebabkan denaturasi karena enzim alfa-amilase memiliki suhu optimum sekitar 30-40 derajat celcius. Pada sampel B dan C sama-sama dilakukan sentrifugasi untuk mempercepta koagulasi dari protein  atau enzim alfa-amilase. Perbedaan perlakuan menyebabkan terjadinya perbedaan aktivitas enzim.  

Filtrat sampel kemudian dianalisis dengan teknik elektoforesis. Sebelumnya ditambahkan terlebih dahulu loading buffer dengan tujuan sebagai penahan sampel dalam sumur gel, sehingga tidak ada yang bermigrasi terlebih dahulu atau agar semua sampel bermigrasi secara bersamaan. Dalam loading buffer mengandung senyawa bromfenol blue yang berfungsi sebagai indikator warna. Oleh karena itu, terjadi perubahan warna filtrat sampel. Indikator bromfenol blue merupakan indikator basa, sehingga daam larutan basa (pH lebih dari 4) akan berwarna biru, sedangkan dalam larutan asam akan berwarna kuning. Perubahan warna yang terjadi pada sampel A dan C adalah dari bening menjadi biru. Sedangkan dalam filtrat sampel B, perubahan warna terjadi dari bening menjadi kuning. Hal ini terjadi karena penambahan TCA menyebabkan sampel menjadi bersuasana asam (pH kurang dari 3) .  Setelah proses elektroforesis selesai, kemudian dilakukan visualisasi dengan merendam gel hasil elektroforesis di dalam larutan pati. Hal ini dilakukan karena pita hasil elektroforesis tidak dapat dilihat secara langsung. Pati akan terperangkap dalam gel poliakrilamid, sedangkan pita zimogram yang mengandung enzim alfa-amilase akan bereaksi dengan pati yaitu menghidrolisis ikatan alfa-1,4-glikosidik pada pati. Akibatnya ketika ditambahkan dengan KI/I2, pita zimogram tersebut akan tidak berwarna atau bening, sedangkan daerag gel yang lain akan berwarna biru. Hal ini terjadi karena dengan adanya I3- akan terperangkap dalam struktur pati dan memberikan warna biru. Jika tidak terdapat pati, maka tidak akan terbentuk komplek pati dengan I3-. Pita zimogram yang berwarna bening menunjukkan adanya aktivitas dari enzim alfa-amilase. 

Hasil visualisasi menunjukkan bahwa sampel A dan C menghasilkan pita bening sedangkan sampel B tidak terbentuk pita bening. Hal ini membuktikan bahwa dalam sampel A dan C masih terdapat enzim alfa-amilase yang aktif, sedangkan dalam sampel B tidak terdapat lagi enzim alfa-amilase yang aktif. Seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya bahwa sampel B dan C dibuat enzim mengalami denaturasi. Hasil menunjukkan bahwa denaturasi yang paling tinggi terjadi pada sampel B, enzim mengalami kerusakan struktur dan aktivitas enzim. Sedangkan dalam sampel C terjadi denaturasi atau perubahan struktur namun tidak menyebabkan kerusakan aktivitas enzim secara permnen atau keseluruhan, sehingga hanya terjadi penurunan aktivitas enzim saja. Jika sampel C dibandingkan dengan sampel A, maka aktivitas yang paling tinggi ditunjukkan terjadi pada sampel A. Hal ini terjadi karena dalam sampel A sama sekali tidak terjadi denaturasi enzim alfa-amilase.  

Selain dianalisis dengan elektroforesis, filtrat sampel A, B dan C juga diuji secara kualitatif. Uji kualittif dilakukan untuk mengetahui ativitas enzim alfa-amilase. Uji kualitatif dilakukan dengan menambahkan filtrat dengan pati 1,25%, lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit, dan kemudian menambahkan KI/I2 serta aquades. Filtrat sampel merupakan larutan tak berwarna dan penambahan pati, filtrat tetap tidak berwarna. Jika terdapat enzim alfa-amilase, maka pati akan mengalami hidrolisis pada ikatan alfa-1,4-glikosidik. Inkubasi dalam suhu kamar dilakukan agar reaksi hidrolisis tersebut dapat berlangsung dengan baik.  Inkubasi dilakukan selama 10 menit, dan reaksi hidrolisis dihentikan dengan menambahkan HCl ke dalam larutan. HCl akan menghentikan reaksi karena HCl dapat menyebabkan protonasi pada enzim alfa-amilase. Penambahn KI/I2 sebagai donor I3-, meyebabkan filtrat menjadi berwarna. Warna yang ditimbulkan pada masing-masing filtrat berbeda-beda. Sampel A dan C menjadi berwarna kuning sedangkan sampel B berwarna biru. Warna kunig dihasilkan karena I3- tidak membentuk kompleks dengan pati karena pati sudah terhidrolisis oleh enzim alfa-amilase. Sedangkan warna biru menunjukkan adanya pembentukan kompleks antara pati dan I3-. Dari uji kualitatif tersebut dapat disimpulkan bahwa aktivitas enzim terjadi pada sampel A dan C, sedangkan dalam sampel B tidak ada lagi aktivitas enzim alfa-amilase. 

Enzim alfa-amilase banyak digunakan pada produk makanan, minuman, fermentasi, industri kertas, pembuatan deterjen, industri farmasi dan industri tekstil. Enzim ini dapat diperoleh dari beberapa bakteri seperti Bacilus Coagulans, B. Stearothermophius dan B.Licheniformis. Selain itu enzim alfa-amilase dapat pula ditemukan dalam jamur dan yeast.  

Daftar Pustaka

Lehninger, Albert, L., David, L., Nelson, Michael, M.Cox. 2000. Lehninger Principles of Biochemistry, 5th ed. New York : Worth Publisher. 

Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka, Croatia. 

Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011. 

Vandooren J, Geurts N, Martens E, Van den Steen PE, Opdenakker G.. 2013. Zymography Methods for Visualizing Hydrolytic Enzymes. Nat Methods, 10 (3) : 211220.